2020年4月20号，中国科学院广州生物医药与健康研究院/广州再生医学与健康广东省实验室彭广敦课题组与景乃禾课题组，在Annual Review of Genomics and Human Genetics上在线发表综述文章Using Single-Cell and Spatial Transcriptomes to Understand Stem Cell Lineage Specification During Early Embryo Development ，评述了利用单细胞RNA测序技术和空间转录组学来理解早期胚胎发育过程中干细胞的谱系特征——包括分子轨迹、基因调控网络、组织谱系发育的空间结构等。                                                                                  

研究胚胎干细胞的命运决定，传统的做法是跟踪细胞运动或在多个发育时间点上的几个分子造成的遗传变动。然而，至今还没有一个完整详细的图谱可以描述人体内所有类型的细胞发育过程和他们之间的发育相关性。scRNA-seq技术为解决这个难题带来一些突破，scRNA-seq技术可以在单个细胞的分子水平上分析差异并允许细胞处于动态变化之中，将生物学过程转化为部分可用数学模型模拟的过程，为胚胎发育和干细胞分化的谱系构建做出了贡献。

01、单细胞RNA测序数据分析

scRNA-seq数据分析的主要任务是降维和可视化。目前，主流的降维方法有：PCA（Principle Component Analysis），主成分分析，是一种线性的降维方法。t-SNE（T-distributed stochastic neighbor embedding），是一种非线性的降维方法，它趋向于保留局部结构。UMAP(uniform manifold approximation and projection)结合了t-SNE和PCA的特征，除了保留全局结构外，还提供了数据的具体可视化。降维方法的发展非常迅速，例如引入机器学习和深度学习用于建模和分析数据，神经网络降维等等都在为单细胞数据分析面临的挑战提供新的解决方案。

scRNA-seq数据分析除了对单个细胞进行聚类、识别细胞类型异质性、揭示主要细胞类型的差异基因表达变化外，破译单个细胞的进展状态对揭示细胞命运决定也具有重要意义。scRNA-seq轨迹推断，可获得谱系信息而不依赖于细胞之间的遗传互作关系：即使细胞仅在固定的时间点被取样，也可以对其发育轨迹进行一定程度的预测。目前已经有多位学者开发了计算工具，例如 Monocle，SCORPIUS，Slingshot等。但是值得注意的是，即使有多种方法和工具供我们推断轨迹，没有一种方法和工具能胜任所有情况，我们需要测试多种方法，取优和互补。

单细胞和空间转录组结合绘制细胞谱系的方法

02、单细胞RNA测序在胚胎发育和干细胞分化中能做什么

scRNA-seq强调连续的细胞表型，提供一个概率框架描述细胞的命运决定，并能绘制所有基因相似的细胞之间的过渡路径和中间状态。然而干细胞的分化命运并非只是简单线性的，其路径具有多种复杂的结构，目前的轨迹推断方法仍有限制，需要改进实验和计算方法来用于复杂的发育轨迹。

此外，利用转录组上单细胞的静态连续变化来解释单个细胞的动态发育轨迹具有很大的局限性，通过TracerSeq、CRISPR/ cas9等技术引入基因组barcode进行遗传标记追踪，与scRNA-seq结合，同时获得谱系变化与分子特征，为追踪生物体谱系提供了强大助力。此外，也有必要通过结合胚胎长时程培养、全景成像技术（in toto imaging）等追踪明确的动态变化过程。与此同时，scRNA-seq在描述细胞中间状态和绘制发育轨迹之外，也能很好的揭示重要谱系转换的基因调控网络。

03、单细胞RNA测序和空间转录组学

单细胞测序技术在将实体组织解离成单个细胞的过程中，不可避免地丢失了空间信息，细胞的位置信息对细胞命运调控机制和细胞谱系发生过程的研究十分重要。整合基因表达和空间信息的传统手段依赖于原位杂交，这些方法能够检测的标记数量有限且无法检测细胞中的分子复杂性。空间转录组信息可以通过直接或者间接的方式获得。在直接获取空间信息的方面，Lubeck等通过漂白或剥除探针进行多轮杂交，发展了针对单个细胞的多重荧光FISH方法，可以同时检测上百个基因的原位杂交信号，大大的提高了研究的通量。此外，Spatial Transcriptomics (ST) 通过将大脑切片覆盖在连接有锚定引物的矩阵芯片上（Array），原位消化细胞使得细胞通透性增大，释放细胞中的mRNA，直接与锚定引物结合，进行原位反转扩增，可得到具有空间位置信息的转录组数据；基于ST类似的方法例如Slide-seq，HDST分别在分辨率和通量上进行了改进。此外，Geographical position sequencing（Geo-seq）通过激光显微切割以及scRNA-seq的结合，具有很高的基因检测效率和空间位置保存的优点。但需要注意的是，空间转录组学还处于持续和快速发展的不成熟阶段，符合高分辨率以及高通量的空间转录组学方案仍有待开发，其相应的计算分析手段也很欠缺。

在间接获取空间转录组信息方面，Satija 等人基于这些已知的原位杂交结果，结合单细胞转录组，开发了Seurat，该算法通过比较每个转录组中表达的基因与从RNA原位杂交获得的几个标志性基因的空间表达模式来推断单细胞转录组的空间位置。但由于具有位置信息的参考坐标基因数量有限，并且单细胞中表达这些位置参考基因时出现一部分基因表达缺失，使得空间定位的成功率大大下降。与此相似，Achim等人开发了另外一种算法，基于一部分具有原位杂交信息的位置参考基因并计算这些位置参考基因在每个细胞中的特异性评分，结合每个细胞与参考位置分区中的相关性系数，来赋予单个细胞最为可能的位置关系。目前获取必要的位置参考基因的方法仍在起步阶段，利用计算映射（computational mapping）进行空间分析也存在许多挑战，亟待未来进一步解决。

04、单细胞RNA测序&空间转录组学用于绘制原肠期起始细胞命运谱图—内胚层细胞命运

发育生物学家Lewis Wolpert曾说，“人生最重要的阶段不是出生和结婚，甚至不是死亡，而是原肠运动”。小鼠原肠运动过程是外、中、内三个胚层的形成过程，伴随着剧烈的细胞增殖和细胞迁移，之后特化的胚层进而发育成形态功能各异的器官组织。因此，原肠运动是决定各个胚层形成以及细胞命运图谱最为关键的一个生物学过程。彭广敦等人在最近的工作中获得了原肠胚发育过程中关键的时空转录组动态信息，Pijuan-Sala等人也利用10X genomics收集了移植后发育阶段的大量单细胞，以期解析从原肠期到早期器官形成的细胞分化图谱。虽然单细胞研究搜集了三个胚层的谱系信息证实了关于组织祖细胞划分的先验知识，基于空间组学与单细胞组学的整合分析，提供了内胚层起始的细胞命运的分歧和统一新视角，为传统命运图谱研究补充了新的生物学证据。

05、展望

单细胞分析从表征细胞异质性，迈进了解释空间组织作用的全新阶段。单细胞多组学和表观遗传学的结合，让研究人员能够研究不同时间尺度下的细胞异质性以及基因组与功能表型之间的分子连接层。

早期胚胎发育和多能干细胞分化体系是探索支持谱系分化机制的理想模型，体内胚胎发育的基因调控、信号转导等相互作用构成了发育机制的核心。创新技术的出现赋予解决细胞在不同时间和空间背景下做出关键的命运抉择问题的可能。单细胞分析和空间转录组分析为描述早期发育过程中细胞谱系的起源和轨迹提供了有效的工具。

由于人类胚胎研究的伦理和法律的约束，研究者们将目光更多地聚集在植入前胚胎，同时也将部分目光转向了体外人类胚胎和非人灵长类胚胎的研究中。比较非人类灵长类和小鼠的原肠期研究，以及体内体外实验模型的相关性，揭示原肠期发育过程中的分子结构和谱系特征将成为胚胎发育研究中的一个极其重要的课题。